血管性癡呆(VD)動物模型

一、 雙側(cè)頸總動脈阻斷模型(Model of occlusion of bilaterial carotis communis artery)

(1)復(fù)制方法  雄性大鼠，體重為250～300g。以水合氯醛(按350～400mg/kg體重的劑量)經(jīng)腹腔注射麻醉后仰臥位，剃除頸部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。頸部正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，用1號線將其行結(jié)扎。縫合切口后再行局部消毒，小心放回籠內(nèi)(每籠一只待其*清醒)。局部傷口縫合前，可用慶大霉素3～5滴滴入局部傷口內(nèi)防止感染。術(shù)后正常飼養(yǎng)12周，自第13周起可開始分組給藥治療。行為學(xué)檢驗(yàn)可采用穿梭箱法和Morris水迷宮分析系統(tǒng)，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。

(2)模型特點(diǎn)  術(shù)后的1～3周，陸續(xù)有動物死亡發(fā)生，其死亡率在20％～40％，因此需根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加手術(shù)動物的總數(shù)。

(3)比較醫(yī)學(xué)  該模型由于阻斷了雙側(cè)頸總動脈，造成了腦部急性供血不足，隨后可通過基底動脈和基底動脈環(huán)血流調(diào)節(jié)以及逐漸形成的側(cè)支循環(huán)所改善，但海馬區(qū)達(dá)不到正常腦供血水平，形成慢性大腦缺血，模擬了人類由于血管粥樣硬化使頭頸動脈逐漸狹窄所致的慢性大腦供血不。水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，動物的定位航行和空間探索能力均降低，癡呆率達(dá)80％左右。該模型可用于研究癡呆腦組織的形態(tài)及病理生理變化機(jī)制，也可用于判定某些治療手段和藥物的效果。

二、 雙側(cè)頸總動脈、椎動脈阻斷模型(Model of occlusion of bilaterial carotis communis artery with vertebral artery)

(1)復(fù)制方法  雄性大鼠，體重為300～350g。以水合氯醛(按350～400mg/kg體重的劑量)經(jīng)腹腔注射麻醉后俯臥位固定于立體定位儀上，剃除頸部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。行背側(cè)頸部正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第1頸椎橫突小孔，用直徑0.5mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動脈，造成閉塞。再將大鼠仰臥位固定，行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，以4號線穿線備用。24h后麻醉，用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5min，間隔1h后再夾閉5min，共夾閉3次。術(shù)后連續(xù)5d經(jīng)肌肉注射慶大霉素，每只2萬U/d。

(2)模型特點(diǎn)  雙側(cè)頸總動脈夾閉后1min，大鼠翻正反射消失，意識喪失，再通1h后意識逐漸恢復(fù)，翻正反射出現(xiàn)。動物造模2周后其主動回避反應(yīng)明顯下降，海馬腦片上 LTP降低，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變明顯。行為學(xué)檢查可采用穿梭箱法和Morris水迷宮法。術(shù)后也有動物死亡發(fā)生，因此要根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加手術(shù)動物的總數(shù)，若出現(xiàn)肢體運(yùn)動障礙的大鼠應(yīng)予以剔除。

(3)比較醫(yī)學(xué)  反復(fù)缺血再灌注和慢性低灌流是血管性癡呆的重要原因。該模型通過燒灼閉塞了雙側(cè)椎動脈，造成慢性腦灌注不足；反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈造成動物腦組織的反復(fù)缺血再灌注，與臨床VD的發(fā)病類似。此模型是目前*的VD造模方法。它較好地模擬了VD的發(fā)病特點(diǎn)，且缺血后生理指標(biāo)較穩(wěn)定，病理改變較為充分明確，卒中指數(shù)低，無明顯肢體運(yùn)動障礙。

三、 多發(fā)性腦梗死性癡呆(DMI)動物模型(Model of dementia of multi-infarction in brain)

(1)復(fù)制方法  SD大鼠，雌雄不拘，體重為350～450g(10月齡以上)的老齡鼠。

1)模型制備  用以水合氯醛(按350～400mg/kg體重的劑量)經(jīng)腹腔注射麻醉，剃除頸部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。頸正中切開皮膚，分離肌肉，暴露左側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)、外動脈。用動脈夾暫時(shí)夾閉頸總動脈，從頸外動脈處逆行穿刺插管注入0.2～0.4ml栓塞液(取SD大鼠無菌自然干燥的血凝塊，研碎分級過篩，選直徑100～200目的微粒溶于生理鹽水中，制成200g/L的懸濁液，即栓塞液)，結(jié)扎頸外動脈。然后開放頸總動脈夾，使栓子通過頸內(nèi)動脈進(jìn)入顱內(nèi)至大腦各動脈，造成多灶性腦梗死。局部傷口縫合前，術(shù)后連續(xù)5d肌肉注射慶大霉素，每只2萬U/d。雙側(cè)多發(fā)性梗死性癡模型制作時(shí)，兩側(cè)頸外動脈同時(shí)注入栓塞液，方法劑量同上。

2)檢測指標(biāo)

①行為學(xué)癥狀  術(shù)后24h觀察動物的活動并進(jìn)行神經(jīng)分級。0級：動物肢體活動無明顯障礙；1級：提起鼠尾頭垂向患側(cè)，前肢下垂；2級：動物行走出現(xiàn)追尾現(xiàn)象；3級：動物行走障礙。

②學(xué)習(xí)記憶障礙測試  采用穿梭箱法和Morris水迷宮法對動物的記憶功能進(jìn)行檢測。

③病理標(biāo)本制作  分別于第10日、20日測定后處死動物。一半動物取腦標(biāo)本做成腦切片，用三苯四唑(TTC)染色，觀察梗塞面積及病理變化。另一半動物取腦標(biāo)本固定于10％甲醛液內(nèi)，作3個(gè)冠狀切面，同時(shí)取小腦、中腦、橋腦、延髓制成切片，HE染色光學(xué)顯微鏡下檢查。

(2)模型特點(diǎn)  單側(cè)栓塞動物手術(shù)后的死亡率在20％～25％，雙側(cè)栓塞動物術(shù)后的死亡率高達(dá)40％～50％。動物麻醉清醒后能站立，但大多數(shù)有不同程度的跛行(尤以后肢明顯)；病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，注入的微球大部分集中在手術(shù)同側(cè)腦半球，少數(shù)在異側(cè)，梗死區(qū)多分布在同側(cè)大腦中動脈和前動脈區(qū)，少數(shù)分布在異側(cè)前動脈區(qū)。TTC染色見，正常腦組織呈深橙紅色，腦缺血區(qū)不著色或著色淺。單側(cè)多發(fā)性腦梗死鼠腦內(nèi)病灶為3～5個(gè)。雙側(cè)腦栓塞腦內(nèi)病灶可達(dá)6～8個(gè)；顯微鏡檢查可見，栓死區(qū)軟腦膜及腦血管充血擴(kuò)張，血管周圍間隙增寬，腦內(nèi)紅細(xì)胞堆積，神經(jīng)細(xì)胞呈局部缺血性改變，胞體不同程度的縮小，核固縮呈三角形或桿狀。梗死灶中常見單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞增生和纖維蛋白聚集。海馬區(qū)AChE陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。

(3)比較醫(yī)學(xué)  與大腦中動脈局灶性腦缺血、雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎致前腦缺血、四血管閉塞致全腦缺血等模型相比， DMI模型較好地模擬了臨床DMI的行為癥狀和病理形態(tài)學(xué)改變，更接近于人類自然栓塞現(xiàn)象。且已被證實(shí)該法造模與人類VD的病理基本相似。DMI模型大鼠可出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，造模成功率高，手術(shù)創(chuàng)傷小，是迄今為止用來評價(jià)抗VD藥物作用及探討藥物作用機(jī)制較為常用的動物模型。DMI模型亦存在著諸多不①DMI模型大鼠存活時(shí)間較短，長也未能超過30d，與臨床病程相差甚遠(yuǎn)。②翼突腭動脈是頸內(nèi)動脈的分支，故在造模過程中，栓子進(jìn)入頸內(nèi)動脈的同時(shí)，也會流入翼突腭動脈，導(dǎo)致顱外梗塞。③術(shù)后結(jié)扎了頸外動脈，阻斷了部分腦血供。④頸外動脈較細(xì)，壓力高，注入栓子困難，進(jìn)針時(shí)易刺穿甚至挑斷血管，造成血液外流。盡管如此，截至目前，DMI動物模型仍不失為一個(gè)常用的較好VD模型。

四、 小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型(Ischemia and reperfusion in mice)

(1)復(fù)制方法  雌性、雄性小鼠皆可，體重為25～30g。術(shù)*h禁食不禁水。小鼠經(jīng)腹腔注射烏拉坦(按1.0g/kg體重的劑量使其麻醉，待翻正反射消失后，仰位固定。頸部皮膚消毒，行正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，38℃下行10min夾閉、20min再通，如此反復(fù)3次，并使動物失血5％～10％的血容量。術(shù)中注意頸部創(chuàng)面點(diǎn)滴2～3滴(2.50×10000U/kg體重)慶大霉素。術(shù)后24h、48h進(jìn)行學(xué)習(xí)、記憶的行為學(xué)檢測。手術(shù)期間注意給動物保溫。

(2)模型特點(diǎn)與比較醫(yī)學(xué)  術(shù)后3～30d神經(jīng)病理學(xué)與行為學(xué)動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，模型小鼠的大腦皮質(zhì)變薄，額葉皮質(zhì)錐體細(xì)胞核固縮，局限性神經(jīng)元數(shù)目減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生，形成多處結(jié)節(jié)。海馬CA1區(qū)細(xì)胞缺失和排列不規(guī)則，且隨時(shí)間推移逐漸加重，至術(shù)后30d，海馬CA1區(qū)細(xì)胞幾乎*脫失，膠質(zhì)細(xì)胞增生，CA2、CA3區(qū)細(xì)胞也嚴(yán)重脫失，呈現(xiàn)海馬硬化。與此同時(shí)模型小鼠表現(xiàn)出顯著的缺血性學(xué)習(xí)記憶障礙。該模型的優(yōu)勢在于其方法簡便可靠，且小鼠價(jià)廉，適合于藥物的初篩。