《LRRK2 G2019S突變通過(guò)Drp1-STX17依賴的方式導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)移功能障礙》LRRK2 G2019S突變通過(guò)增強(qiáng)Drp1 Ser616磷酸化，導(dǎo)致STX17從線粒體脫落，從而損害星形膠質(zhì)細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元的線粒體轉(zhuǎn)移功能，而抑制Drp1磷酸化的DUSP6可恢復(fù)這一過(guò)程并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。成果發(fā)表在Translational Neurodegeneration雜志（IF：15.2）；

《Translational Neurodegeneration》是一本專注于神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域的開(kāi)放獲取、同行評(píng)議的英文學(xué)術(shù)期刊。期刊創(chuàng)刊于2012年1月，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)科、神jing病學(xué)研究所與施普林格·自然集團(tuán)合作創(chuàng)辦。涵蓋所有神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)研究，包括但不限于帕金森病及運(yùn)動(dòng)障礙、阿爾茨海默病及其他癡呆、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病等。感興趣的主題包括流行病學(xué)、病原學(xué)、診斷標(biāo)志物、新藥開(kāi)發(fā)、治療及預(yù)防等。影響因子為15.2，5年影響因子為15.0；由BioMed Central出版，電子標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)出版物號(hào)為 2047-9158；

研究背景：

帕金森病是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性喪失。盡管目前以多巴胺替代療法為主的對(duì)癥治療能夠改善癥狀，但無(wú)法阻止或延緩疾病的進(jìn)展，因此探索能夠抑制神經(jīng)元凋亡的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制具有重要意義。遺傳因素和環(huán)境因素共同參與了帕金森病的發(fā)生。其中，LRRK2 G2019S突變是zui常見(jiàn)的帕金森病致病基因變異，可顯著增強(qiáng)LRRK2激酶活性，導(dǎo)致線粒體自噬障礙、線粒體DNA損傷和線粒體分裂異常等病理改變。同時(shí)，前期研究已證實(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以將健康的線粒體轉(zhuǎn)移給受損的多巴胺能神經(jīng)元，這可能是腦內(nèi)一種內(nèi)源性的神經(jīng)修復(fù)機(jī)制。然而，在LRRK2 G2019S突變背景下，這種線粒體轉(zhuǎn)移功能是否受損，以及其具體分子機(jī)制尚不清楚。

研究方法：

研究采用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)，從健康個(gè)體和攜帶LRRK2 G2019S突變的帕金森病患者外周血中成功誘導(dǎo)分化獲得多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，建立了模擬腦內(nèi)微環(huán)境的“星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元"共培養(yǎng)體系。通過(guò)魚藤酮處理模擬環(huán)境毒素暴露，實(shí)驗(yàn)首先觀察了不同基因背景下線粒體轉(zhuǎn)移效率的變化；進(jìn)而利用MitoTracker標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)，定量檢測(cè)共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的線粒體數(shù)量，并測(cè)定神經(jīng)元ATP水平以評(píng)估其功能狀態(tài)。在分子機(jī)制探討層面，通過(guò)siRNA技術(shù)分別敲低SNARE家族蛋白STX17、VAMP3和SNAP23，篩選影響線粒體釋放的關(guān)鍵蛋白；運(yùn)用免疫熒光共定位分析STX17與線粒體外膜蛋白TOM20的共定位關(guān)系；采用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證Drp1與STX17的相互作用；并通過(guò)Western blot檢測(cè)不同處理下Drp1總蛋白及其Ser616位點(diǎn)磷酸化水平的變化。，使用Drp1磷酸化抑制劑DUSP6進(jìn)行功能挽救實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)STX17線粒體定位、線粒體轉(zhuǎn)移效率及神經(jīng)元樹突損傷的改善作用。

主要研究結(jié)果：

1. iPSCs誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元

iPSCs來(lái)源于健康供體和攜帶LRRK2 G2019S雜合突變帕金森病患者的PBMCs，該患者是我團(tuán)隊(duì)報(bào)道的中國(guó)shou例攜帶LRRK2 G2019S突變的帕金森病病例[31]。iPSCs的核型分析顯示正常的46XY核型，無(wú)染色體異常。初，使用雙重抑制劑SB431542和Noggin抑制SMAD信號(hào)通路，誘導(dǎo)iPSCs神經(jīng)化為NSCs。通過(guò)向培養(yǎng)體系中添加各種小分子，成功實(shí)現(xiàn)了向星形膠質(zhì)細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元的分化。并通過(guò)Western blot和免疫熒光對(duì)兩種細(xì)胞的標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1，人iPSC來(lái)源的多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)

2. LRRK2 G2019S突變減少線粒體從星形膠質(zhì)細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)移

在突變型共培養(yǎng)體系（突變星形膠質(zhì)細(xì)胞+突變神經(jīng)元）中，200 nM魚藤酮處理后神經(jīng)元樹突長(zhǎng)度減少約60%，損傷程度顯著重于野生型共培養(yǎng)體系（減少44%），表明突變神經(jīng)元對(duì)環(huán)境毒素的抵抗力降低。當(dāng)野生型星形膠質(zhì)細(xì)胞與突變神經(jīng)元共培養(yǎng)時(shí)，樹突長(zhǎng)度減少約50%，損傷輕于突變共培養(yǎng)體系，提示健康星形膠質(zhì)細(xì)胞能部分緩解突變神經(jīng)元的損傷。MitoTracker線粒體示蹤顯示，魚藤酮呈劑量依賴性地減少神經(jīng)元內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的線粒體數(shù)量，突變體系中線粒體數(shù)量減少70%，野生型減少60%，說(shuō)明突變導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)移功能受損更嚴(yán)重。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基證實(shí)，突變星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放線粒體的能力下降更明顯。此外，將魚藤酮處理后的條件培養(yǎng)基與神經(jīng)元共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，突變神經(jīng)元ATP水平下降更顯著，表明線粒體轉(zhuǎn)移功能受損導(dǎo)致神經(jīng)元能量供應(yīng)不足。這些結(jié)果共同揭示了LRRK2 G2019S突變通過(guò)損害線粒體轉(zhuǎn)移增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)環(huán)境毒素的敏感性。

圖2，LRRK2 G2019S突變與魚藤酮聯(lián)合作用導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性，并損害線粒體從星形膠質(zhì)細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)移

3. 膜融合相關(guān)蛋白STX17通過(guò)不依賴SNARE的機(jī)制參與線粒體輸出

通過(guò)siRNA分別敲低STX17、VAMP3和SNAP23后發(fā)現(xiàn)，STX17敲低使星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基中線粒體數(shù)量減少70.70%，而VAMP3和SNAP23敲低僅減少約27%，表明STX17是線粒體釋放的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。免疫共沉淀顯示VAMP3與STX17、SNAP23均無(wú)結(jié)合，免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)STX17與線粒體外膜蛋白TOM20共定位，而VAMP3和SNAP23不與TOM20共定位，證明STX17的作用不依賴經(jīng)典SNARE復(fù)合物形成。在魚藤酮處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，STX17與TOM20的共定位程度隨魚藤酮濃度升高而降低，且突變型星形膠質(zhì)細(xì)胞中這種下降更為顯著。值得注意的是，線粒體標(biāo)志物TOM20和VDAC1的蛋白水平在不同基因型和不同濃度魚藤酮處理下均無(wú)顯著變化，表明線粒體數(shù)量保持穩(wěn)定，排除了線粒體自噬或降解對(duì)共定位結(jié)果的影響。然而，200 nM魚藤酮使野生型星形膠質(zhì)細(xì)胞STX17熒光強(qiáng)度降低27%，突變型降低41%，Western blot驗(yàn)證了這一結(jié)果。進(jìn)一步的共定位分析證實(shí)，STX17定位于線粒體外膜的能力下降是導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)移功能受損的直接原因。這些結(jié)果揭示了STX17在線粒體釋放中的關(guān)鍵作用及其受突變和環(huán)境毒素協(xié)同調(diào)控的機(jī)制。

圖3的核心研究發(fā)現(xiàn)是STX17通過(guò)不依賴經(jīng)典SNARE復(fù)合物的機(jī)制參與星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體釋放，且LRRK2 G2019S突變與魚藤酮協(xié)同損害STX17的線粒體定位。

圖3，STX17通過(guò)不依賴SNARE的機(jī)制參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體輸出

4. 線粒體Drp1在線粒體轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用

通過(guò)siRNA敲低Drp1后，星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基中線粒體數(shù)量顯著減少，共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的線粒體也明顯減少，證實(shí)Drp1是線粒體釋放的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。免疫共沉淀結(jié)果顯示，Drp1與STX17存在直接相互作用，為Drp1調(diào)控STX17功能提供了分子基礎(chǔ)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著魚藤酮濃度升高，Drp1 Ser616位點(diǎn)磷酸化水平呈劑量依賴性增加，且突變型星形膠質(zhì)細(xì)胞中這一磷酸化水平在各濃度下均顯著高于野生型，尤其在200 nM魚藤酮處理下差異zui為明顯。值得注意的是，總Drp1蛋白水平在兩種基因型和不同魚藤酮濃度下均無(wú)顯著變化，表明突變和毒素主要影響Drp1的磷酸化狀態(tài)而非表達(dá)量。這些結(jié)果共同揭示：LRRK2 G2019S突變?cè)鰪?qiáng)Drp1 Ser616磷酸化，這種過(guò)度磷酸化可能干擾Drp1與STX17的正常相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致STX17從線粒體脫落，終損害線粒體轉(zhuǎn)移功能。該發(fā)現(xiàn)闡明了從遺傳突變到分子事件再到功能損傷的關(guān)鍵通路，為后續(xù)藥物干預(yù)提供了明確靶點(diǎn)。

圖4，Drp1參與STX17依賴的線粒體轉(zhuǎn)移

5. LRRK2 G2019S突變與魚藤酮處理聯(lián)合影響Drp1 Ser616位點(diǎn)的磷酸化

在200 nM魚藤酮處理的野生型和突變型星形膠質(zhì)細(xì)胞中，LRRK2抑制劑PF-06447475僅顯著降低突變型細(xì)胞的Drp1 pSer616水平，對(duì)野生型無(wú)顯著影響。相比之下，Drp1磷酸化抑制劑DUSP6在兩種基因型細(xì)胞中均能顯著降低Drp1 pSer616水平，且呈劑量依賴性?？侱rp1蛋白水平在各處理組間無(wú)顯著變化。結(jié)果表明，DUSP6能有效抑制由LRRK2 G2019S突變和魚藤酮共同誘導(dǎo)的Drp1過(guò)度磷酸化，適合用于后續(xù)的功能挽救實(shí)驗(yàn)。并比較了兩種抑制劑對(duì)Drp1 Ser616磷酸化的影響，為后續(xù)挽救實(shí)驗(yàn)篩選出DUSP6。在200 nM魚藤酮處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，LRRK2抑制劑PF-06447475僅顯著降低突變型細(xì)胞的Drp1 pSer616水平，對(duì)野生型無(wú)顯著影響。而Drp1磷酸化抑制劑DUSP6在兩種基因型細(xì)胞中均能劑量依賴性地顯著降低Drp1 pSer616水平，總Drp1蛋白水平無(wú)變化。結(jié)果表明，DUSP6能有效抑制由LRRK2 G2019S突變和魚藤酮共同誘導(dǎo)的Drp1過(guò)度磷酸化，適合用于后續(xù)的功能挽救實(shí)驗(yàn)。

圖5，Drp1抑制劑DUSP6可降低野生型和LRRK2 G2019S突變型星形膠質(zhì)細(xì)胞中Drp1 pSer616的水平

6. DUSP6挽救受損的線粒體轉(zhuǎn)移和多巴胺能神經(jīng)元損傷

在200 nM魚藤酮處理下，STX17與TOM20共定位減少（野生型降37.7%，突變型降46%），而DUSP6處理后共定位顯著增加（野生型增37%，突變型增50%）。Western blot驗(yàn)證STX17蛋白水平變化，但明確其線粒體靶向能力受Drp1磷酸化調(diào)控。功能上，DUSP6使線粒體轉(zhuǎn)移效率提高（野生型增27%，突變型增53%），神經(jīng)元樹突長(zhǎng)度改善（野生型增12%，突變型增111%）。結(jié)果表明，DUSP6通過(guò)抑制Drp1 Ser616磷酸化，阻止STX17從線粒體脫落，恢復(fù)線粒體轉(zhuǎn)移功能，對(duì)突變型神經(jīng)元具有顯著保護(hù)作用。

圖6，DUSP6可挽救野生型和表達(dá)LRRK2 G2019S的星形膠質(zhì)細(xì)胞中受損的線粒體轉(zhuǎn)移和多巴胺能神經(jīng)元損傷

7. 全文總結(jié)

研究shou次揭示LRRK2 G2019S突變通過(guò)Drp1-STX17通路損害星形膠質(zhì)細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元的線粒體轉(zhuǎn)移功能，從而加劇環(huán)境毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。研究發(fā)現(xiàn)，突變與魚藤酮協(xié)同增強(qiáng)Drp1 Ser616磷酸化，導(dǎo)致STX17從線粒體外膜脫落，線粒體釋放減少；而Drp1磷酸化抑制劑DUSP6可恢復(fù)STX17線粒體定位、提高線粒體轉(zhuǎn)移效率并保護(hù)神經(jīng)元。并shou次將線粒體轉(zhuǎn)移功能障礙確立為L(zhǎng)RRK2突變致帕金森病的新機(jī)制，提出Drp1-STX17軸為治療靶點(diǎn)，并證實(shí)DUSP6的神經(jīng)保護(hù)作用。然而研究基于單例中國(guó)患者來(lái)源的iPSC，樣本量有限，且LRRK2 G2019S在中國(guó)人群罕見(jiàn)，研究結(jié)果向其他人群或其他LRRK2突變類型的普適性有待驗(yàn)證。