Co-ip染色質免疫共沉淀準備工作

更新時間：2023-03-07

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　　Co-ip染色質免疫共沉淀準備工作：

　　1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次，后一次吸干PBS;

　　2. Co-ip染色質免疫共沉淀加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞、10cm培養皿或150cm2培養瓶，0.5ml/5×106個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶)

　　3. Co-ip染色質免疫共沉淀用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15min(EP管插冰上，置水平搖床上)

　　4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉移到一個新的離心管中

　　5. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠

　　6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠(50%)，4℃搖晃10min(EP管插冰上，置水平搖床上)，以去除非特異性雜蛋白，降低背景

　　7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子

　　8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月)

　　9. Co-ip染色質免疫共沉淀用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高(如10 μg/μl)

　　10. 加入體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異

　　11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育

　　12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體"(兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG)

　　13. 14000rpm瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合，可以使用PBS

　　14. Co-ip染色質免疫共沉淀用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定(60 μl足夠上三道)

　　15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應再次煮5min變性。